ポイント
・カテプシンC阻害剤がラットANCA関連血管炎モデルの病変を改善。
・カテプシンC阻害により、ANCA関連血管炎モデル内で生じる病因物質NETsが減少。
・NETsが病因となる様々な疾患に対する新規治療開発の進展に期待。

概要

【背景】
ANCA関連血管炎は好中球細胞質抗原に対する自己抗体ANCAの出現に伴って発症する全身性小型血管炎で、高齢者に多く、急速に悪化する腎機能障害や肺出血などを特徴とする疾患です。厚生労働省が指定する難病の一つであり、2020年における特定医療費の受給者は約2万人で、その数は年々増加しています。副腎皮質ステロイドやシクロホスファミドなどの免疫抑制剤、CD20分子に結合するリツキシマブや補体C5a受容体に結合してC5aに拮抗するアバコパンなどの分子標的治療薬の有効性が確認されており、一定の治療効果が得られていますが、これら治療への不応例や治療後に再燃する例があり、新たな治療薬の開発が強く求められています。また、既存の治療薬には免疫力の低下をきたす副作用があり、治療に関連した感染症の併発は解決すべき大きな課題となっています。
NETsは病原微生物の生体内への侵入を受けて好中球が細胞外に放出するDNA複合体で、好中球が細胞質に保有する殺菌酵素を纏っています。好中球から放出されたNETsはDNAで病原微生物を絡めとり、殺菌酵素を浴びせて病原微生物を殺傷します。NETsは生体にとって重要な感染防御機構ですが、過剰に形成されると生体にとって不利益をもたらすことも知られています。ANCA関連血管炎では、ANCAが好中球に結合することによって好中球からNETsが過剰に放出され、これが病原微生物を殺傷する代わりに自身の血管内膜を損傷することによって血管炎が発症します（図1）。
NSPは好中球が保有する一群の酵素で、好中球エラスターゼやプロテイナーゼ3、カテプシンGなどが含まれます。各種のNSPに共通した活性化機構として、骨髄において好中球が分化する過程で、未熟型（非活性型）NSPのN末端側の二つのペプチドが切断され、成熟型（活性型）に変化することが知られています。成熟型（活性型）の好中球エラスターゼは、NETsの形成において重要な役割を果たしています（図1）。
カテプシンCは骨髄における好中球の分化過程で作用し、未熟型（非活性型）NSPのN末端側の二つのペプチドを切断し、成熟型（活性型）に変換する酵素です（図1）。

【研究手法】
まず、生後4週齢の雄性Wistar Kyotoラット24匹に対し、既報どおり、好中球に対する自己抗体の抗原となり得るヒト由来MPOを免疫し、ANCA関連血管炎動物モデルを作製しました。
次に、上記ラットを8匹ずつ3群（疾患群、低用量治療群、高用量治療群）に分け、低用量治療群にはMOD06051を0.3 mg/kg、高用量治療群にはMOD06051を3 mg/kg、1日2回連日経口投与しました。疾患群には同量の溶媒を1日2回経口投与しています。投与期間はモデル作製日から42日間とし、42日目に全個体からサンプリングを行いました。
そして、血清中のANCA抗体価（酵素結合免疫吸着測定法）、血中NETs形成好中球（フローサイトメトリー法）、腎組織におけるNETs沈着（免疫蛍光法）、腎組織傷害（PAS染色法）、肺出血（HE染色法）を評価しました。

【研究成果】
MOD06051は9種類のカテプシンファミリー酵素の中でカテプシンCのみを選択的に阻害し、ラットへの投与後に末梢血のカテプシンC活性を阻害しました。またヒト造血幹細胞から分化させた好中球や連投後のラットの骨髄由来の好中球のNSPの活性を阻害し、様々な刺激によるNETs形成も阻害しました。
血清中のANCA抗体価については、正常ラット8匹を陰性対照とすると、疾患群では陰性対照に比べて有意に高いANCA抗体価を示しました。MOD06051投与群では、用量によらず、ANCA抗体価は疾患群と同程度に高い値を示しました（図2a）。
血中NETs形成好中球については、正常ラット8匹を陰性対照とすると、疾患群では陰性対照に比べて血中好中球のNETs形成割合が有意に高く、MOD06051投与群では、用量依存的かつ有意にその割合が減少し、正常レベルまで改善しました（図2b）。
腎組織におけるNETs沈着については、疾患群では糸球体に浸潤する好中球の約10%がNETsを形成していましたが、MOD06051投与群では用量依存的かつ有意に腎組織におけるNETs沈着が減少しました（図2c）。
腎組織傷害については、疾患群では約10%の糸球体に病変が認められましたが、MOD06051投与群では傷害されている糸球体の割合が有意に減少しました（図2d）。
肺出血については、MOD06051の用量依存的に肺出血が減少し、高用量投与群では疾患群に比べて有意に改善しました（図2e）。

【今後への期待】
カテプシンC阻害剤は、ANCA関連血管炎の新規治療薬候補です。本研究においてANCA抗体価への影響が認められなかったことは、抗体産生能すなわち液性免疫能には影響を及ぼさないことを意味しており、幅広い免疫機能を抑制する既存の治療薬とは異なり、免疫力低下を引き起こさない可能性を示しています。
また、カテプシンCを遺伝的に欠損させたマウスでは、好中球の活性酸素放出、接着、遊走、ファゴサイトーシスへの影響が無いことが報告されていることから、好中球の感染防御機能への影響を回避しつつ病態を改善できる可能性が見込まれます。今後、MOD06051の臨床試験において、本薬剤の安全性と有効性が確認されることが期待されます。
また、NETsはANCA関連血管炎以外にも、敗血症、痛風、糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチなど様々な疾患の病因ともなっていることが知られています。そのため、カテプシンC阻害は、これらNETsが病因として関与する種々の疾患に対しても有効な治療戦略となる可能性が期待されます。

【謝辞】
本研究は、JSPS科研費（JP21H0295802）の助成を受けたものです。

論文情報

【参考図】

図1. 好中球による組織傷害に対するカテプシンC阻害剤の作用メカニズム。

図2. カテプシンC阻害剤によるANCA関連血管炎治療効果。
（a）血清中のANCA抗体価。（b）血中NETs形成好中球の割合。好中球のうち、NETs形成を示す好中球の割合を示している。（c) 腎組織におけるNETs沈着。糸球体に浸潤する好中球のうち、NETs形成を示す好中球の割合を示している。（d）腎組織傷害。傷害されている糸球体の割合を示している。（e）肺出血。顕微鏡下で観察される肺出血病巣数を示している。Normal（正常群）、Pathology（疾患群）、Low dose（低用量治療群）、High dose（高用量治療群）。
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, **** p<0.0001.

【用語解説】
＊1 NSP … Neutrophil Serine Protease（好中球セリンプロテアーゼ）のこと。好中球が保有する一群の酵素で、好中球エラスターゼやプロテイナーゼ3、カテプシンGなどが含まれる。
＊2 NETs … Neutrophil Extracellular Traps（好中球細胞外トラップ）のこと。病原微生物の生体内への侵入を受けて好中球から放出され、放出されたNETsは病原微生物を殺傷する。一方、ANCA関連血管炎では、ANCAが結合することで好中球からNETsが放出され、放出されたNETsは病原微生物を殺傷する代わりに自身の血管内膜を損傷するため、血管が炎症を起こす。
＊3 ANCA … Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibody（抗好中球細胞質抗体）のこと。好中球の細胞質に存在するミエロペルオキシダーゼやプロテイナーゼ3に結合する自己抗体であり、病原性を有する。
＊4 Cit-H3 … Citrullinated Histone H3（シトルリン化ヒストンH3）のこと。NETsが形成される過程で、DNAを巻き付けているヒストンH3がシトルリン化を受ける。シトルリン化によりヒストンH3の構造が変化し、DNAの巻きほどきが生じる。Cit-H3が存在することがNETs形成の指標となる。

カテプシンC阻害剤の血管炎治療効果を証明～ANCA関連血管炎の新規治療薬として期待～(PDF)